مرجع تخصصی آب و فاضلاب

«ويژگي های ميكروبيولوژي آب آشاميدني»

 

   يادآوري1- در صورتي كه اشرشياكلي از نمونه آب جدا شود، بايد بررسي و اقدام لازم انجام شود.

   يادآوري2- با وجود اينكه اشرشياكلي شاخص دقيق تري براي آلودگي مدفوعي مي باشد، جستجوي باكتري هاي كليفرم گرما پاي نيز به عنوان جايگزين، قابل قبول مي باشد، در صورت لزوم، آزمون هاي تاييدي مناسب بايد انجام شود.

«ويژگي هاي باکتريولوژي آب اشاميدني بسته بندي شده»

 

 

يادآوري 1- ميکروارگانيسم هاي قابل کشت تنها در زمان بسته بندي و يا بيشينه دوازده ساعت پس از بسته بندي (در صورت نگه داري در دماي پنج درجه سلسيوس) مي تواند مورد ملاک قرار گيرد.

«ويژگيهای باکتريولوژيکي آب معدني»

 

 

« جدول حد استاندارد ميکروبي آب معدني»

حد مجاز شمارش کلي باکتري ها در مظهر چشمه (شمارش باکتري هاي هتروتروفيک)

 

 

حد مجاز شمارش کلي باکتريها (حداکثر تا 12 ساعت پس از بطري شدن)

 

 

حد مجاز آلودگي باکتريايي

 

..

1)  نمونه آلوده قابل قبول: منظور حداکثر تعداد نمونه اي است که در آن شمارش باکتريها مي تواند بين M و m باشد.

روش‏هاي آزمايش

آيين‌كار آزمون‌هاي باكتريولوژيكي آب

  1- هدف

 هدف از تدوين اين آئين‏كار , ارائه يك راهنما 1 جهت انجام آزمون‏هاي باكتريولوژيكي آب مي‏باشد            

 اين آئين كار شامل آماده سازي نمونه

 و روش‏هاي مختلف شمارش انواع ميكروارگانيسم‏هاست .

  2- دامنه كاربرد

 اين آئين‏كار در مورد آب آشاميدني , آب معدني بطري شده , آب استخر و شناگاههاي طبيعي كاربرد دارد .

- مواد اوليه

 به منظور بدست آوردن نتايج هماهنگ , لازم است از مواد اوليه‏اي با كيفيت و درجه خلوص يكسان , استفاده نمود آب مورد مصرف نيز بايد از نوع تقطير شده با تجهيزات شيشه‏اي 2 بوده و عاري از مواد بازدارنده از رشد ميكروارگانيسم‏ها باشد . در صورتي كه آب مقطر از آب كلرينه شده تهيه مي‏شود بايد قبل از تقطير ; كلر آن خنثي شود .

3-2- محيط كشت - براي آماده كردن محيطهاي كشت دستورالعمل سازنده بايد به طور دقيق رعايت شود . بسياري از محيطهاي كشت را مي‏توان پس از سترون شدن به صورت كاملا دربسته در دماي 22-18 درجه سلسيوس به مدت حداكثر 3 ماه نگه داري نمود . محيطهائي كه تحت شرايط ستروني تقسيم و توزيع مي‏شوند را مي‏توان در دماي 10-4 درجه سلسيوس حداكثر به مدت يك ماه نگه‏داري نمود . كليه محيطهاي كشت بايد قبل از مصرف از نظر آلودگي , تبخير زياد و يا ساير نشانه‏هاي فساد كنترل شوند .

- ستروني

 4-1- محيطهاي كشت و محلول‏هاي رقيق كننده - در اغلب موارد محيطها و محلول‏هاي رقيق كننده پس از توزيع در ظروف مناسب در دماي 121±1 درجه سلسيوس (فشار 245 كيلو پاسكال) به مدت 15 دقيقه سترون مي‏شود . در مواردي خاص مي‏توان طبق توصيه سازنده از دما و زمان مختلف استفاده نمود . در مورد محيطهائي كه نسبت به حرارت ناپايدار هستند ستروني با استفاده از صافي‏هاي سترون با اندازه روزنه حداقل 0/22 ميكرون انجام مي‏شود .

 4-2- وسايل و تجهيزات - وسايل و تجهيزات فلزي , شيشه‏اي و يا ساير تركيبات مقاوم به حرارت به وسيله يكي از روش‏هاي زير سترون مي‏شود .

 4-2-1- دماي خشك - در دماي 160±2 درجه سلسيوس به مدت حداقل 1/5 ساعت و يا در دماي 170±2 درجه سلسيوس به مدت حداقل يك ساعت . 2-4-2- دماي مرطوب - در دماي 121±1 درجه سلسيوس (فشار 245 كيلو پاسكال به مدت حداقل 20 بيست دقيقه .

آماده‏سازي نمونه

 به منظور توزيع يكنواخت ميكروارگانيسم‏ها , بايد قبل از آزمون نمونه را با تكان دادن ظرف , كاملا مخلوط نمود

. در صورتي كه ظرف حاوي نمونه بصورت كامل پر مي‏باشد , ابتدا مقداري از آن را تحت شرايط ستروني بيرون ريخته و سپس عمل مخلوط كردن را انجام دهيد .

6- شمارش در محيط جامد

 روش براساس برداشت حجم معيني از نمونه و تلقيح آن بر روي سطح و يا درون محيط كشت خاصي است . فرض براين است كه پس از گرمخانه‏گذاري هر ميكروارگانيسم تكثير يافته و ايجاد پرگنه قابل مشاهده در محيط كشت مي‏كند

 . روش كار مي‏تواند به سه صورت به شرح زير باشد :

6-1- روش مخلوط كردن نمونه با محيط كشت درون پليت - (پورپليت) 4 روش براساس مخلوط كردن حجم معيني از نمونه و يا رقتي از آن با محيط ذوب شده تا دماي نزديك به انجماد مي‏باشد . پس از گرمخانه‏گذاري پرگنه‏هاي روي سطح محيط و يا درون آن شمارش مي‏شود .

6-2- روش كشت سطحي - در اين روش حجم معيني از نمونه يا رقتي از آن روي سطح محيط كشت حاوي آگار گسترده مي‏شود و پس از گرمخانه‏گذاري كليه پرگنه‏هاي روي سطح محيط شمارش مي‏شود .

-3- روش صافي غشائي - روش براساس عبور دادن حجم معين نمونه از صافي است ميكروارگانيسم‏ها روي صافي باقي مي‏ماند سپس صافي روي محيط آگاردار و يا بالشتك جاذب 6 آغشته  به محيط مايع قرار مي‏گيرد . پس از گرمخانه‏گذاري , پرگنه‏هاي روي سطح صافي‏ها شمارش مي‏شود

. در مواردي كه جستجوي ميكروارگانيسم‏هاي بي هوازي موردنظر است , ابتدا صافي درون پليت قرار مي‏گيرد (به گونه‏اي كه سطح چهارخانه آن به طرف پائين باشد). و سپس با محيط حاوي آگار ذوب شده پوشانيده مي‏شود .

حداكثر حجم نمونه آزمايشي بستگي به قابليت صاف شدن نمونه و صافي مورد استفاده دارد .

در مورد آب آشاميدني حجم استاندارد براي صاف كردن نمونه 100/ ميلي ليتر است . با صافي‏هائي با اندازه 0/45 ميكرون

7 امكان صاف كردن چند ليتر آب وجود دارد كه در اين صورت روش آزمايش از حساسيت بالائي برخوردار است .

-3-2- انتقال صافي - پس از برداشتن صافي باكمك پنس سترون آن را به يک پليت حاوي محيط آگار دار منتقل ميکنيم

- گرمخانه گذاري

 كليه پليت‏ها را به صورت وارونه درون گرمخانه قرار داد .

زمان و دماي گرمخانه گذاري بسته به نوع ميكروارگانيسم مورد جستجو متفاوت بوده و ممكن است در دو مرحله انجام شود . - شمارش

 پس از پايان زمان گرمخانه گذاري پليت‏ها و صافي‏ها را سريعأ مورد بررسي قرار دهيد و در صورتي كه امكان بررسي سريع آن نيست . مي‏توان پليت‏ها را در دماي 4 تا 5 درجه سلسيوس حداكثر به مدت 24 ساعت نگه داري نمود .

در مورد يك سري رقت متوالي پليتي را شمارش كنيد كه بين 25 تا 300 پرگنه دارد .

براي محاسبه نتايج , از آنجا كه هر پرگنه از يك ميكروارگانيسم منشأ گرفته مي‏توان نتايج را به عنوان تعداد واحد پرگنه ساز 10  در حجم معين نمونه محاسبه نمود .

- شمارش و غني سازي بوسيله تلقيح در محيط كشت مايع

 روش براساس تلقيح حجم معيني از نمونه در محيط كشت مايع است تا از رشد ميكروارگانيسم‏هاي خاص اطمينان يابيم . كاربرد روش فوق در موارد زير است .

 10-1- آزمون براي وجود يا عدم وجود ميكروارگانيسم‏ها - پس از تلقيح حجم معين در محيط كشت مايع و گرمخانه گذاري , با پيدايش تظاهرات ناشي از رشد ميكروارگانيسم مي‏توان به وجود يا عدم وجود آن در حجم معين نمونه پي برد .

 10-2- آزمون براي غني سازي - در مواردي كه تعداد احتمالي باكتري در نمونه كم است و شمارش نيز مطرح نيست مي‏توان حجم معيني از نمونه را در محيط كشت مايع فاقد عوامل بازدارنده از رشد تلقيح نمائيد . پس از گرمخانه گذاري آن را به محيط كشت انتخابي جامد منتقل كنيد .

- آزمون براي شمارش - روش تخمين محتمل‏ترين تعداد .(N.P.M) 11

 روش براساس نظريه احتمالات بوده و فرض براين است كه ميكروارگانيسم‏ها با يك توزيع يكنواخت و به صورت انتخابي در نمونه پخش شده‏اند

. پس از تلقيح حجم‏هاي مختلف نمونه به لوله‏هاي حاوي محيط مايع و گرمخانه گذري , تغييرات ويژه اي ناشي از رشد باكتري‏ها مانند كدورت , توليد گاز , تغيير PH ظاهر خواهد شد

 . با در نظر گرفتن تعداد لوله‏هاي مثبت و با استفاده از جداول آماري مي‏توان بيشترين تعداد احتمالي باكتري‏ها را تخمين زد .

- انتخاب روش

 انتخاب روش آزمون آب به عوامل متعددي از جمله ويژگي‏هاي فيزيكي - شيميائي نمونه , و نوع ميكروارگانيسم مورد جستجو دارد

. انتخاب روش در موارد مختلف به شرح زير است .

 11-1- در مواردي كه آب حاوي ذرات معلق است , استفاده از روش صافي غشائي مناسب نمي‏باشد . (به علت مسدود شدن صافي‏ها توسط ذرات معلق و حتي موجودات زنده مانند ميكروپلانكتون‏ها) مسدود شدن روزنه صافي‏ها باعث كاهش عبور مواد غذائي از صافي شده و در نتيجه عدم تشكيل پرگنه مي‏شود).

 11-2- در مورد آبهاي خيلي كدر روش .N.P.M تنها روشي است كه مي‏توان استفاده نمود .

-4- در مواردي كه مواد محلول در آب زياد است استفاده از روش صافي غشائي توصيه مي‏شود

11-5- در مواردي كه احتمال وجود بيش از 100 پرگنه روي هر صافي وجود دارد استفاده از روش صافي غشائي از حساسيت لازم برخوردار نمي‏باشد .

 11-6- در مواردي كه تعداد ميكروارگانيسم‏ها در نمونه كم است ( كمتر از 100 عدد در هر ميلي ليتر ) استفاده از روش كشت سطحي مناسب نمي‏باشد .

11-8- در مورد آب‏هاي حاوي ذرات معلق استفاده از روش كشت ((مخلوط كردن نمونه با محيط كشت)) (پورپليت) به دليل شمارش ذرات به جاي پرگنه و ((روش كشت سطحي )) به دليل نداشتن حساسيت لازم مناسب نمي‏باشد .

11-10- به طور كلي روش .N.P.M به دليل تخميني بودن نسبت به روش شمارش در محيط جامد داراي دقت كمتري مي‏باشد . توصيه مي‏شود در صورت امكان به طور هم زمان از هر دو روش استفاده نمود .

جستجو و شمارش كليفرم ها در آب به روش چند لوله اي

1 ـ هدف

 هدف ارائه يك روش مرجع براي شناسائي و شمارش كليفرم‏ها , كليفرم‏هاي گرماپاي و اشريشياكلي فرضي در آب به وسيله كشت در محيط مايع به روش چند لوله‏اي و محاسبه بيشترين تعداد احتمالي 4 آنها در نمونه مي‏باشد .

  2 ـ دامنه كاربرد

 اين استاندارد در مورد كليه آبها , حتي آبهايي كه داراي ذرات و مواد معلق هستند , كاربرد دارد .

ـ تعاريف

3 ـ 1 ـ كليفرم‏ها :

 منظور ميكروارگانيسم‏هايي هستند كه مي‏توانند در شرايط هوازي در دماي35±0/5 و 37±0/5 درجه سلسيوس در محيط مايع لاكتوز رشد كرده و در مدت 48 ساعت توليد اسيد و گاز كنند .

 3 ـ 2 ـ كليفرم‏هاي گرماپاي :

 منظور كليفرم‏هاي تعريف شده در بند 3 ـ 1 هستند كه قادرند در مدت 24 ساعت در دماي44±0/5 و44/5±0/25 درجه سلسيوس نيز توليد اسيد و گاز كنند .

 3 ـ 3 ـ اشريشياكلي فرضي :

 منظور كليفرم‏هاي مقاوم به حرارت تعريف شده در بند 3 ـ 2 هستند كه قادرند در مدت 24 ساعت در دماي 44±0/5و 44/5±0/25درجه سلسيوس از تريپتوفان توليد اندول و از لاكتوز و مانيتول توليد گاز كند .

ـ اساس روش

 4 ـ 1 ـ تلقيح نمونه يا رقتي از آن به يك سري لوله‏هاي حاوي محيط مايع انتخابي لاكتوز .

 4 ـ 2 ـ گرمخانه گذاري لوله‏ها در دماي 35 تا 37 درجه سلسيوس به مدت 24 تا 48 ساعت .

 4 ـ 3 ـ تجديد كشت هريك از لوله‏هاي داراي كدورت و گاز مثبت به محيط انتخابي تأييدي .

 4 ـ 4 ـ در مواردي كه جستجوي اشريشياكلي فرضي مورد نظر است , براي بررسي توليد اندول از لوله‏هاي فوق در يك محيط ترپتوفان دار كشت داده مي‏شود .

 در مورد بررسي كليفرم‏ها , محيطهاي تأييدي در دماي 25 تا 37 درجه سلسيوس به مدت 48 ساعت قرار مي‏گيرد و در مورد بررسي كليفرم‏هاي گرماپاي و اشريشياكلي فرضي در دماي 42 درجه سلسيوس به مدت 24 ساعت گرمخانه گذاري مي‏شود . سپس با استفاده از جداول آماري بيشترين تعداد احتمالي كليفرم‏ها , كليفرم‏هاي گرماپاي و اشريشياكلي فرضي در 100 ميلي‏ليتر از نمونه محاسبه مي‏شود . (از تعداد لوله‏هايي كه نتايج تأييدي مثبتي داشته‏اند).

ـ روش كار

 

7 ـ 1 ـ آماده سازي :

 آماده سازي و تهيه رقت‏هاي مورد نياز را برطبق استاندارد ملي ايران به شماره 356 انجام

 7 ـ 2 ـ گرمخانه گذاري :

 لوله‏هاي تلقيح شده را براي مدت 48 ساعت در دماي 35±0/5 يا37±0/5 درجه سلسيوس قرار دهيد .

 7 ـ 3 ـ بررسي :

 پس از مدت 18 تا 24 ساعت لوله‏ها را بررسي نماييد . لوله‏هايي كه داراي كدورت همراه با توليد گاز و اسيد (در مورد محيطهايي كه داراي معرف PH هستند) هستند , به عنوان نتيجه مثبت در نظر بگيريد

 و لوله‏هايي را كه منفي بوده و يك يا تمامي تغييرات فوق را نشان نداده است , مجددا تا 48 ساعت در گرمخانه قرار دهيد .

ـ 4 ـ آزمون‏هاي تاييدي :

 از آنجا كه واكنش مثبت در لوله‏هاي حاوي جدا ساز 5 تنها مربوط به كليفرم‏هاي فرضي است , بنابراين انجام آزمون تأييدي بر روي محيط كشت انتخابي اهميت داشته و ترجيحأ پرگنه‏هاي شاخص به مرحله آزمون تأييدي انتقال يابد

 . از هر يك از لوله‏هاي واكنش مثبت در يك يا چند لوله حاوي محيطهاي تأييدي) كشت دهيد تا توليد اندول و گاز مورد بررسي قرار گيرد .

 يادآوري 1: در صورتي كه جهت جداسازي از محيط ساده آبگوشت لاكتوز استفاده مي‏شود , توصيه مي‏گردد

 از دو محيط انتخابي‏تر تأييدي آبگوشت لاكتوز  - صفرا - سبزدرخشان و اشريشياكلي براث نيز استفاده شود .

ـ 4 ـ 1 ـ كليفرم‏ها :

 براي تاييد وجود كليفرم‏ها , توسط حلقه كشت از لوله‏هاي واكنش مثبت برداشت نموده و به لوله حاوي محيط آبگوشت لاكتوز  - صفرا - سبزدرخشان تلقيح نماييد . لوله را در دماي 35 تا 37 درجه سلسيوس گرمخانه گذاري نموده و پس از 48 ساعت از نظر توليد گاز بررسي كنيد .

 7 ـ 4 ـ 2 ـ كليفرم‏هاي گرماپاي :

 توسط حلقه كشت از لوله‏هاي واكنش مثبت برداشت نموده و به لوله حاوي محيط آبگوشت اشريشياكلي تلقيح نماييد . لوله را در دماي 44 درجه سلسيوس گرمخانه گذاري نموده و پس از 24 ساعت از نظر توليد گاز بررسي نمائيد .

 7 ـ 4 ـ 3 ـ اشريشياكلي فرضي :

 توسط حلقه كشت از لوله‏هاي واكنش مثبت بند 7 ـ 3 برداشت نموده و به لوله حاوي محيط آب تريپتونه تلقيح نماييد . سپس لوله‏ها را به مدت 24 ساعت در دماي 44 درجه سلسيوس قرار دهيد

 . پس از پايان اين مدت مقدار 0/2 تا 0/3 از معرف كواكس به لوله‏ها اضافه نماييد . پس از تكان دادن لوله‏ها , ايجاد رنگ قرمز دليل بر حضور اندول است .

ـ 5 ـ آزمون اكسيداز : برخي از ميكروارگانيسم‏هايي كه در آب يافت مي‏شوند , ممكن است در بسياري از جهات مشابه با كليفرم‏ها باشند . اين ميكروارگانيسم‏ها فقط در دماي كمتر از 37 درجه سلسيوس قادر به تخمير لاكتوز و توليد گاز هستند ولي از نظر آزمونهاي تأييدي منفي هستند و حضور آنها در آب حائز اهميت نمي‏باشد .

گونه‏هاي آئروموناس نيز كه به طور طبيعي در آب وجود دارند , فقط در دماي 37 درجه سلسيوس يا كمتر از لاكتوز توليد اسيد و گاز مي‏كنند و موجب تداخل در روند آزمون مي‏شوند . اين ميكروارگانيسم‏هاي اكسيداز مثبت بوده و قابل تشخيص از كليفرم‏ها مي‏باشند .

 7 ـ 5 ـ 1 ـ آزمون اكسيداز را با كشت خالص از باكتري تخميركننده لاكتوز كه روي محيط آگار مغذي رشد كرده است , به صورت زير انجام دهيد .

 - 2 يا 3 قطره از معرف اكسيداز را روي يك كاغذ صافي در يك پيليت قرار دهيد .

 - با استفاده از يك ميله شيشه‏اي , سواب يا سوزن كشت پلاتيني (نيكل و كروم نباشد) مقداري از پرگنه را روي كاغذ صافي قرار دهيد .

 - ظهور رنگ ارغواني مايل به آبي تيره در مدت 10 ثانيه را به عنوان واكنش مثبت درنظر بگيريد .

كيفيت آب- جستجو و شناسايي اشريشيا كلي و  كلي فرم ها

قسمت اول : روش صافي غشايي

هدف ، تعيين روش آزمون شناسايي و شمارش اشريشياكلي و كلي فرم ها در آب بوسيلة صافي غشايي به دو روش((سريع)) و ((استاندارد)) مي باشد .

2        دامنه كاربرد

اين استاندارد در مورد تمامي انواع آب به غير از موارد زير كاربرد دارد :

2-1     آب هايي كه حاوي مقادير قابل توجه ذرات و مواد معلق باشند، به گونه اي كه در عمل صاف سازي ايجاد اختلال كند .

2-1     آب هايي كه داراي تعداد زيادي از ميكروارگانيسم هاي ديگر باشند، به گونه اي كه رشد آنها مانع از شمارش دقيق كليفرم ها شده و يا وجود آنها با فرايند صاف سازي تداخل ايجاد كنند .

اصطلاحات و تعاريف

در اين استاندارد اصطلاحات و / يا واژه ها با تعاريف زير به كار مي رود :

4-1     باكتري هاي لاكتوز مثبت

(روش استاندارد)

منظور، باكتري هايي هستند كه در شرايط هوازي در دماي 3 ± 36 درجه سلسيوس بر روي محيط كشت انتخابي و افتراقي داراي لاكتوز رشد نموده، در مدت 3 ± 21 ساعت توليد اسيد كنند

4-2     كليفرم ها

(روش استاندارد)

منظور، باكتري هاي لاكتوز مثبت تعريف شده در بند 4-1 است كه اكسيداز منفي مي باشند .

4-3     اشريشيا كلي

(روش استاندارد)

منظور، باكتري هاي كلي فرم تعريف شده در بند 4-2 است كه در دماي 5/0 ± 44 درجه سلسيوس به مدت 3 ± 21 ساعت از تريپتوفان توليد ايندول كنند .

          روش استاندارد

روش استاندارد براساس قرار دادن صافي غشايي بر روي محيط كشت انتخابي جامد لاكتوز دار و گرمخانه گذاري آن در دماي 3 ± 36 درجه سلسيوس بمدت 3 ± 21 ساعت مي باشد .

كلني هاي مشخص تشكيل شده در سطح صافي غشايي، بعنوان باكتري هاي لاكتوز مثبت شمارش مي شود. پس از انتخاب كلني هاي مشخص و تجديد كشت آن ها، آزمونهاي تأييدي شامل توليد ايندول و همچنين آزمون اكسيداز انجام مي گردد و سپس تعداد احتمالي باكتريهاي کلي فرم و اشريشياكلي در 100 ميلي ليتر نمونه محاسبه مي شود .

6        نمونه برداري

6-1     مقدار يك تا پنج ليتر آب را با رعايت شرايط زير نمونه برداري كنيد :

آب -  جستجو و شناسايي كليفرم ها به روش وجود -

 عدم وجود - روش آزمون ميكروبيولوژي

مقدمه

شناسايي باكتري هاي نشانگر يكي از بهترين راه ها براي ارزيابي كارائي روشهاي تصفية آب است . باكتر هاي كليفرم به دليل سرعت و سهولت جدا سازي و شناسايي ، شاخص ميكروبي مناسبي  براي تعيين كيفيت آب آشاميدني هستند اين باكتريها نبايد در آب آشاميدني تصفيه شده وجود داشته باشند . وجود باكتريهاي كليفرم در آب نشانگر فرآيند ناكافي و يا آلودگي پس از تصفيه است .

1- Presence- Absence (P-A) Coliform test .

 

يكي از روش هاي ساده  براي شناسايي كلــيفرم ها در آب روش آزمون وجود - عدم وجود كليفرم1 مي باشد. اين روش امكان آزمون تعداد زيادي از نمونه هاي آب را به طور همزمان فراهم مي كند

4-1     كليفرم ها

گروهي از باكتري هاي هوازي و بي هوازي اختياري ، گرم منفي ، ميله اي شكل و بدون اسپور هستند كه قادرند در شرايط هوازي در محيط هاي كشت انتخابي لاكتوزدار در دماي 5/0 ± 35 درجه سلسيوس در مدت 24 تا  48 ساعت توليد اسيد و گاز كنند .

          اساس روش

اين روش  براساس تلقيح حجم معيني از نمونه آب به محيط انتخابي لاكتوز دار و گرمخانه گذاري در دماي 5/0 ± 35 درجه سلسيوس انجام مي پذيرد . سپس با استفاده از محيط هاي كشت انتخابي و تائيدي ، وجود كليفرم ها تائيد مي شود .

6        نمونه برداري

دست کم 500 ميلي ليتر آب را (طبق استاندارد ملي 4208) سال 1376 آئين کار نمونه برداري از آب جهت آزمونهاي باکتريولوژي نمونه برداري كنيد .

7-1-1 آبگوشت P-A 1


1- P-A broth

2طرز تهيه :

تركيبات فوق را با جوشاندن در آب مقطر حل نمائيد . سپس به حجم هاي 50 ميلي ليتر در ظروف شيشه اي با گنجايش 250 ميلي ليتري ريخته ، و در اتوكلاو با دماي 1 ± 121 درجه سلسيوس به مدت 12 دقيقه سترون كنيد . pH  نهايي محيط بايد 2/0± 8/6 باشد.

روش اجراي آزمون

9-1     تلقيح نمونه

نمونه مورد آزمــون را به مــدت 5 ثانــيه بشدت تكان دهيد. سپس 100 ميلي ليتر از آن را به 50 ميلي ليتر محيط كشت آبگوشت P-A بند 7-1-1 با غلظت سه برابر تلقيح نموده و پس از يكنواخت شدن ، در دماي 5/0 ± 35 درجه سلسيوس به مدت 24 تا 48 ساعت گرمخانه گذاري نمائيد  .

9-2     بررسي نمونه

نمونه تلقيح شده بند 9-1 را پس از پايان زمان گرمخانه گذاري بررسي كنيد . مشاهده رنگ زرد در  محيط کشت آبگوشت P-A  نشانگر تخمير لاكتوز و توليد اسيد و گاز همچنين حباب گاز

است. كه با تكان دادن ظرف به آرامي حباب گاز و کف را مي توانيد در سطح آن مشاهده كنيد. توليد اسيد و گاز نشانگر وجود احتمالي كليفرم ها در نمونه مورد آزمون مي باشد كه براي تائيد آن بايد آزمون تائيدي انجام پذيرد .

9-3     آزمون تائيدي

براي تائيد وجود كليفرم ها ، با استفاده از حلقه کشت سترون ، از كشت بند 9-2 که توليد اسيد و گاز نموده اند ، برداشت نموده و به محيط كشت آبگوشت لاكتوز - صفرا - سبز درخشان بند

7-1-2 انتــقال داده و در دماي 5/0± 35 درجه سلسيوس به مدت 24 تا 48 ساعت گرمخانه گذاري نمائيد. مشاهده گاز و کف در محيط فوق ، نشانگر وجود باكتري هاي كليفرم در نمونه مورد آزمون مي باشد .

10      بيان نتايج

نتايج را بصورت "" كليفرم ها در 100 ميلي ليتر نمونه آب وجود دارد "" و يا "" كليفرم ها در 100 ميلي ليتر نمونه آب وجود ندارد "" بيان كنيد .

روش شمارش بيشترين تعداد احتمالي اشريشياكلي با استفاده از MUG   روش شمارش بيشترين تعداد احتمالي 1 اشريشيا كلي 2 با استفاده از  (MUG) 3

  1 - هدف

 هدف از تدوين استاندارد ارائه روش براش شمارش اشريشيا كلي با استفاده از MUG ميباشد . كلي فرم‏هاي ديگر را نيز با اين روش ميتوان شمارش نمود .

- تعريف

 3-1- اشريشياكلي : در اين استاندارد , منظور از اشريشيا كلي باكتري گرم منفي از خانواده انتروباكترياسه است كه ميتواند در دماي 30 درجه سلسيوس تركيب MUG را شكسته و تركيبي با خاصيت فلوئورسانس ايجاد نمايد .

 اين باكتري همچنين قادر به توليد اندول از تريپتوفان ميباشد .

 3-2- كلي فرم‏ها : نام غير رسمي براي تعدادي از باكتريهاي گرم منفي كه به خانواده انتروباكترياسه تعلق دارند . در اين استاندارد منظور از كلي فرم‏ها , كليه باكتريهاي گرم منفي بدون اسپوري هستند كه در درماي 30 درجه سلسيوس تا مدت حداكثر 48 ساعت ميتوانند لاكتوز را تخمير , گاز توليد نموده و نيز پرگنه‏هاي مشخص بر روي محيط جامد بند (6-2) ايجاد كنند .

- اساس و روش

 تركيب 4 - متيل آبلي فريل بتا - د -  گلوكورونيد توسط آنزيم بتا - د - گلوكورونيداز 4 شكسته شده و تركيب حاصل متيل آمبلي فرون ماده است كه زير لامپ ماوراي بنفش با طول موج 366 نانومتر خاصيت فلوئورسانس از خود نشان ميدهد .

 لامپهاي ماورابنفش با طول موج كوتاه مناسب نميباشند .

 94 درصد از سويه‏هاي اشريشياكلي اين خاصيت را از خود نشان مي‏دهند .

 - آزمايش توليد اندول از تريپتوفان براي شناسايي اشريشياكلي بر روي همان محيطي كه حاوي MUG است انجام مي‏گيرد .

 

روش آزمایش شمارش بشقابی

محیط کشت مورد نیاز نوترینت آگار می باشد. روش آزمایش به این ترتیب است که 1 میلی لیتر از نمونه مورد نظر را در پلیت استریل ریخته و 10 میلی لیتر از محیط کشت مورد نظر را به آن اضافه می کنیم و به صورت    8  پلیت را تکان می دهیم سپس محیط کشت را پس از جامد شدن به مدت 24 ساعت در انکوباسیون 35 درجه قرار می دهیم و پس از آن در صورت رشد کلنی ها آنها را روی کلنی کانتر قرار داده و شمارش کلنی ها را انجام می دهیم.

 

 

رنگ آمیزی گرم

معروفترین نوع رنگ آمیزی مرکب نوع گرم می باشد . این روش مفیدترین روش تشخیص باکتریها می باشد.

میکروبشناسی بنام کریتستیان گرم در سال 1884 بطور تصادفی واکنشی را کشف کرد که بعدها واکنش رنگ آمیزی گرم نامیده شد.

بر این اساس باکتریها با توجه با ساختمان دیواره یاخته ای (سلولی) به دو بخش بزرگ و کلی تقسیم می شوند: باکتریهای گرم مثبت و گرم منفی . تفاوت عمده بین این دو گروه تفاوتهای ساختاری(ساختمانی) بین این دو گونه می باشد به این ترتیب که در گونه گرم مثبتها در دیواره سلولی نوعی پلی ساکارید بکار رفته و دیواره سلولی آن کمی ضخیم تر می باشد در صورتیکه در دیواره سلولی نوع گرم منفی مقدار چربی بیشتری بکار رفته و دیواره سلولی آن کمی نازکتر از نوع گرم منفی می باشد.

بر همین اساس در رنگ آمیزی گرم با توجه به این تفاوت مهم در دیواره سلولی ، از دو نوع رنگ استفاده می شود ، رنگ اولیه کریستال ویوله می باشد . هنگامیکه محلول کریستال ویوله به گسترش باکتریایی اضافه می شود این رنگ با ریبونوکلئات موجود در دیواره سلولی ترکیب شده و کمپلکس کریستال ویوله – ریبونوکلئات را بوجود می آورد و بعد از شستشوی رنگ اضافی ، محلول ید را بکار می برند . این محلول ید که ترکیبی فلزی می باشد به رنگ متصل شده و یک ترکیب رنگی غیر محلول ایجاد می کند بنام کمپلکس کریستال ویوله –ید که در سر دیگر آن متصل شده به ریبونوکلئات موجود در دیواره سلولی و تشکیل کریستال ویوله – ید – ریبونوکلئات داده است در حالیکه در باکتریهای گرم منفی چنین کمپلکسی ایجاد نمی شود. این پیوند در باکتریهای گرم مثبت بسیار پایدار است و در مرحله بعدی توسط ماده رنگ بر شکسته نمی شود و رنگ بنفش کریستال ویوله را در خود حفظ کرده بنابراین باکتریهای گرم مثبت زیر میکروسکوپ بنفش رنگ دیده می شوند.

از طرفی در دیواره سلولی باکتریهای گرم منفی مقدار چربی بیشتری بکار رفته است بنابراین چربیها در الکل استن که در مرحله بعدی بعنوان رنگ بر بکار می روند ، محلول هستند و در اثر این واکنش چربیها از دیواره سلولی خارج شده و در اثر شستشو با حلال رنگ بر ، رنگ کریستال ویوله هم از سطح باکتری خارج می شود . با خروج چربی توسط ماده رنگ بر ، بر اندازه منافذ دیواره سلولی افزوده شده که این امر باعث بی رنگ شدن سریع باکتریهای گرم منفی می شود .در این مرحله باکتریهای گرم منفی از کریستال ویوله پاک می شوند . بنابراین بعد از شستشو توسط آب و افزوده شدن رنگ دوم یعنی سافرانین (فوشین) ، این رنگ به دیواره سلولی باکتریهای گرم منفی جذب شده و باکتریها به رنگ قرمز در می آیند و در بررسی میکروسکوپی ، باکتریهای گرم منفی برنگ قرمز دیده می شوند.

اکثر باکتریهای موجود ، گرم منفی هستند البته بعضی از باکتریها ، مخمرها و تعدادی از کپکها گرم مثبت هستند.

بنابراین مراحل رنگ آمیزی گرم را می توان به شرح زیر بیان نمود:

1-        تهیه گسترش روی لام : ابتدا از نمونه باکتری  یک گسترش روی لام تهیه می کنید.

2-        رنگ آمیزی با کریستال ویوله : در این مرحله مقداری از رنگ کریستال ویوله را با قطره چکان به روی سطح گسترش میکروبی روی لام بریزید و بگذارید 1 دقیقه بماند تا رنگ در دیواره سلولی میکروبها نفوذ کند.

3-        مرحله شستشو: پس از سپری شدن مدت زمان 1 دقیقه ، رنگ اضافی روی لام را خالی کرده و با استفاده از آب مقطر سطح روی گسترش را شستشو دهید.

4-        مرحله اضافه کردن محلول ید : جند قطره از محلول ید را روی گسترش پخش نموده و بگذارید بمدت 1 دقیقه به همان حالت بماند . بعد محلول اضافی را خالی کرده و با آب مقطر لام را شستشو دهید.

5-        مرحله رنگ بری با استفاده از استن – الکل : لام را با زاویه 45 درجه نگهدارید بعد با استفاده از محلول رنگ بر الکل – استن که بر روی گستره می ریزید بسرعت آنرا بی رنگ کنید. دقت کنید مرحله بی رنگ سازی بیش از اندازه نباشد. بعد از آن لام را بسرعت بشوئید . این عمل ، بی رنگ شده را متوقف خواهد کرد.

6-        رنگ آمیزی با سافرانین : در این مرحله سطح گسترش را با رنگ ثانویه یعنی سافرانین بپوشانید و 30 تا 60 ثانیه صبر کنید . بعد از آن رنگ اضافی را خالی کرده و با آب مقطر لام را شستشو دهید.

7-        لام رنگ آمیزی شده را آهسته روی کاغذ خشک کن قرار دهید ولی کاغذ را روی گسترش نکشید.

نکات مهم :

1-        حرارت بیش از اندازه هنگام تثبیت گسترش باعث پاره شدن دیواره سلولی باکتری شده . بنابراین باکتری گرم مثبت رنگ اولیه (کریستال ویوله) را هنگام رنگ بری از دست می دهد و رنگ ثانویه را جذب می نماید و در نتیجه باکتری گرم مثبت ، بصورت گرم منفی دیده می شود.

2-        اگر گسترش ضخیم باشد هنگام مرحله بی رنگ شدن ، ممکن است مانند یم گسترش معمولی رنگ نشود و این مسئله باعث خطا در تشخیص شما در گرم منفی یا مثبت بودن باکتری خواهد شد.

3-        غلظت درست و تازه بودن رنگها هم در رنگ آمیزی موثر است .

4-        رنگ بری بیش از حد ممکن است باعت پاره شدن جدار باکتریهای گرم مثبت شده در نتیجه این باکتریها رنگ کریستال ویوله خود را از دست داده و رنگ ثانویه را جذب می نماید و بصورت گرم منفی دیده می شود.

5-        دقت شود هنگام تهیه گسترش روی لام از محیط کشت ، سن کشت باکتری باید 24 ساعت یا کمتر باشد . بنابراین در محیط کشتهایی که از عمر آنها گذشته و کهنه شده اند ، در قابلیت نفوذ دیواره سلولی باکتریها تغییراتی حاصل می شود که خاصیت گرم مثبت بودن را از دست می دهد.

در رنگ آمیزی گرم مثبت باکتریها را به 5 گروه تقسیم بندی می کنند:

1-        میله ای (باسیل ) گرم مثبت 2- میله ای گرم منفی 3- کوکوس (گرد) گرم مثبت 4- کوکوس گرم منفی 5- باکتریهای بدون واکنش به رنگ آمیزی گرم.

در این رنگ آمیزی می توان هر باکتری ناشناخته ای را در یکی از این 5 گروه قرار داده و با اطمینان 4 گروه دیگر را حذف کرد و به مطالعه در مورد آن باکتری پرداخت .

خصوصیات باکتریهای گرم مثبت و گرم منفی :

1-        باکتریهای گرم مثبت نسبت به پنی سیلین و مواد ضد باکتریایی حساستر از گرم منفی ها هستند.

2-        گرم مثبت بودن یک باکتری خصوصیتی است که براحتی از بین می رود اما گرم منفی بودن تحت هیچ شرایطی از بین نمی رود . پس هنگام تشخیص و رنگ آمیزی باید به این نکته هم توجه داشت . یعنی در لامهای رنگ آمیزی شده گرم متبت ، باکتریهای گرم منفی هم دیده می شود اما در لامهای گرم منفی از یک کشت خالص هرگز باکتریهای گرم مثبت دیده نمی شوند.

3-        باکتریهای گرم منفی سخت رشد ترند یعنی نیاز غذایی آنها پیچیده تر است .

4-        باکتریهای گرم منفی نسبت به مواد اسیدی و قلیایی قوی و آنزیم لیزوزیم حساسترند. همه اینها موجب پاره شدن دیواره سلولی این باکتری و هضم و متلاشی شده آن می شوند.

طرز تهیه رنگها و محلولهای گرم :

1-        کریستال ویوله :

- کریستال ویوله                        2 گرم

- اتانول 95%                         20سی سی

- اگزالات آمونیوم(خالص)           8/.گرم

- آب مقطر                             80سی سی

کریستال ویوله را در اتانول حل کنید. اگزالات آمونیوم را در آب حل کنیدو سپس دو محلول را روی هم ریخته و بخوبی مخلوط کنید.

2-        محلول ید:

- ید                                       1 گرم

- یدور پتاسیم                           2 گرم

- آب مقطر                             300 سی سی

ید و یدور پتاسیم را با هم در هاون بسائید تا کاملا نرم شود . مقدار کمی آب اضافه کنید تا محتویات هاون شسته شود. بقیه آب را هم اضافه کرده و کاملا مخلوط کنید . این محلول را باید در شیشه تیره رنگ نگداری کنید.

3-        محلول سافرانین :

- سافرانین                              25 گرم

- اتانول 95%                         10سی سی

- آب مقطر                             100سی سی

سافرانین را در اتانول حل کنید . آب مقطر را اضافه کرده و خوب مخلوط کنید . محلول را از کاغذ صافی عبور دهید.

4-        محلول استن – الکل :

- اتانول 95%                        70 سی سی

- استن                                  30سی سی

دو محلول را کاملا با هم مخلوط کنید.
شمارش بشقابی HPC

تعداد كلني هاي باكتريايي داخل يا روي محيط هاي جامد حاوي تركيبات آلي نظير منابع انرژي و كربن اطلاعاتي را درمورد غلظت و تراكم باكتريهاي هتروتروفيك قابل كشت در آب و يا ديگر محيط هاي  مورد بررسي به ما مي دهد. اين مورد به عنوان شمارش بشقابي هتروتروفيك (HPC) خوانده مي شود كه در ابتدا توسط كخ در سال 1881 مورد استفاده قرار گرفت و اولين ابزار نشان دهندة كيفيت ميكروبي آب (تصفيه شده ) بود. چند سال بعد اين روش در تعدادي از كشورهاي اروپايي به كار گرفته شد.

در آغاز قرن بيستم روش ها و محيط هاي متعددي جهت تشخيص شاخص هاي باكتريايي مدفوعي ابداع شد. اما شيوع كريپتوسپوريديوزيس ميلواكي در سال 1993 مشخص نمود كه عدم وجود كليفرمها هميشه نمي تواند بيانگر اطمينان از سلامت ميكروبي آب باشد. مقادير HPC مي تواند اطلاعاتي را در مورد ميزان فعاليت ميكروبي در آب ارائه نمايد و بنابراين مي تواند جهت كنترل و بهينه سازي فرآيندهاي تصفيه و روشها و فعاليتهاي مهندسي مربوط به تصفيه و توزيع به كار رود.
باكتريهاي هتروتروف گروهي ميكروارگانيسم هستند كه قادر به سنتز همه مواد مغذي مورد نياز خود نمي باشند و لذا به منابع خارجي مواد آلي و غير آلي جهت تغذيه وابسته مي باشند. تعداد قابل توجهي  از باكتريهايي كه در سيستم هاي آب آشاميدني مي باشند از جمله باكتريهاي هتروتروف مي باشند. HPC را نمي توان به عنوان يك شاخص در شناخت نوع ميكروارگانيسم موجود به كار برد. در ضمن نتايج HPC يك ارزيابي دقيق از تراكم و غلظت كل باكتريهاي هتروتروف نمي باشد و نتايج آن مي تواند بيانگر ارگانيسم هاي قابل كشت موجود باشد. تركيب و تراكم گونه هاي باكتريايي كه در آزمايش HPC بازيابي مي شوند متفاوت بوده و به فاكتورهاي متعددي از جمله مشخصات فيزيكي و شيميايي آب  بستگي دارد. اختلاف در شمارش و نوع ارگانيسم هاي موجود در نمونه هاي يكسان از يك مكان نيز به وقوع مي پيوندد. ميكروارگانيسم هاي بازيابي شده در تست HPC مي تواند شامل ارگانيسم هايي باشد كه به طور طبيعي در آب و محيط وجود دارند و يا ارگانيسم هايي كه از منابع آلاينده مختلف وارد مي شوند.

باكتريهاي هتروتروف مجموعه اي از باكتريهاي هوازي و بيهوازي اختياري هستند كه به جز دو جنس آن باسيلوسو  ميكروكوكوس گرم منفي بوده و جنس هاي  پروتئوس، انتروباكتر،آئروموناس، سيتروباكتر، سودوموناس، كلبسيلا، فلاوباكتريوم، سراشيا، موراكسلا، الكالي ژنز و آسينتوباكتر را شامل مي شوند. جنس هاي غالب اين مجموعه، باكتريهاي سودوموناس، سراشيا، انتروباكتر، فلاوباكتريوم و آسينتوباكتر هستند . علاوه بر جنس هاي ياد شده، برخي از باكتريهاي مهم در پزشكي نظير: مايكوباكتريوم، استافيلوكوكوس و سراشيا نيز در تركيب باكتريهاي هتروتروف ممكن است حضور داشته باشند. باكتريهاي هتروتروف ساكن طبيعي بدن انسان و حيوانات بوده و از طريق مدفوع دفع مي شوند. برگ درختان ، خاك ، آب ، قطره هاي باران و حتي بزاق دهان نيز تعداد متنابهي از اين باكتريها را در خود جاي داده اند.  هر اينچ مربع از پوست سالم انسان، ميزبان صدها هزار باكتري هتروتروف است. اين باكتريها در بستر هاي كربن فعال، رزين ها، صافي هاي ماسه اي و غشايي ، شبكه هاي توزيع و اجزاي آن، خنك كننده ها، مخازن تحت فشار و حتي جدار بطري هاي آب وجود دارند.بعضي از اعضاي اين گروه ، مانند سودوموناس ، آئروموناس ، كلبسيلا ، فلا ووباكتريوم ، انتروباكتر ، سيتروباكتر، سراشيا، اسينتوباكتر و پروتئوس از جمله پاتوژنهاي فرصت طلب بوده و جمعيت خاصي چون نوزادان و افراد مسن و بيمار را در معرض خطر عفونت قرار مي دهد. اما در مورد تأثيرات تعداد زياد باكتريهاي HPC روي سلامتي انسان اطلاعات اندكي در دسترس مي باشد. در آبهاي آشاميدني تعداد باكتريهاي HPC ممكن است كمتر از CFU 1 تا بيش از CFU 104 در ميلي ليتر متغير باشد و عمدتاً متأثر از درجه حرارت ، وجود كلر باقيمانده و ميزان مواد آلي قابل جذب[1] مي باشند. ميزان HPC نبايد از 500 ارگانيسم در ميلي ليتر بيشتر باشد. با توجه به موارد زير، HPC  جهت اپراتورهاي واحدهاي تصفيه آب مفيد مي باشد.

1-     ارزيابي كارايي فرآيندهاي مختلف تصفيه ، از جمله گندزدايي، در يك واحد تصفيه آب

2-     پايش كيفيت بيولوژيكي آب خروجي از تصفيه خانه در طي ذخيره و توزيع آن

3-     تعيين رشد باكتريايي روي سطوح مواد مورد استفاده در سيستمهاي تصفيه و توزيع

4-     تعيين قابليت رشد مجدد يا رشد بعدي در آب تصفيه شده در سيستم هاي توزيع

به طور كلي تعداد شمارش شدة باكتريهاي هتروتروف به نوع محيط كشت ، زمان و دماي انكوباسيون و سرانجام روش كشت آن ها وابسته بوده و با افزايش دما و زمان انكوباسيون تعداد شمارش دهندة آن ها افزايش مي يابد.كربن آلي قابل جذب (AOC ) به ويژه در غلظت هاي بيش از 15 ميكروگرم در ليتر، باقيمانده عامل گندزدا در آب، جنس شبكه، دما، كدورت و تعداد اوليه باكتريهايي كه از طريق تصفيه خانه وارد شبكه مي شوند عامل هاي اثرگذار بر نرخ رشد جمعيت ميكروبي در خطوط آبرساني محسوب مي شوند. انجمن كارهاي آبي ايالات متحده (AWWA) شرايط مناسب براي رشد باكتريهاي هتروتروف را در مقادير بيش از 50 ميكروگرم در ليتر AOC ، دماي بالاتر از 10 درجه سانتيگراد و كلر باقيمانده آزاد كمتر از 2/0 ميلي گرم در ليتر دانسته است . بر طبق اعلام سازمان حفاظت محيط زيست ايالات متحده (EPA) حداكثر تعداد مجاز HPC در شبكه توزيع CFU/100ml 500 است و در صورتي كه اين مقدار به 1500 كلني در هر ميلي ليتر فزوني يابد، نشانة نقص در تأسيسات آبرساني و به احتمال نياز به شستشوي شبكه و مخزن است.